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在探索生命奧秘的征途上，蛋白質(zhì)-相互作用（PPI）的研究至關(guān)重要。傳統(tǒng)的BRET（生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移）技術(shù)曾是研究細胞動態(tài)事件的有力工具，但其應(yīng)用卻常常受限。
生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（BRET）檢測試劑盒由Promega在20世紀90年代末開發(fā)，對于理解細胞動態(tài)事件至關(guān)重要，特別是蛋白相互作用（PPI）。在BRET中，發(fā)光供體的激發(fā)態(tài)能量可以轉(zhuǎn)移到受體熒光素，導(dǎo)致受體分子以特征發(fā)射波長發(fā)出。這些類型的檢測試劑盒迅速成為測量PPI的有用工具，它們不僅被認為是通用的、快速的和生物學上有用的，而且也適合用于PPI調(diào)節(jié)的活細胞藥物發(fā)現(xiàn)的高通量篩選。然而，傳統(tǒng)的BRET技術(shù)存在一些局限性：
Promega公司推出的NanoBRET?消除了所有的限制。在NanoBRET?中，可以使用一種新的、效率高得多的供體-受體對來研究PPI（見圖1）。這一新組合包括一個非常亮的熒光素酶（NanoLuc）作為能量供體，以及一個用熒光標記的Halotag融合蛋白作為能量受體。 圖 1. NanoBRET?檢測 A中：使用NanoBRET研究蛋?質(zhì)A和B之間的相互作用。供體是NanoLuc??蛋?質(zhì)A融合體，受體是熒光標記的HaloTag??蛋?質(zhì)B融合體。 B中：顯示了NanoBRET的分離光譜和計算方法。 新的供體（NanoLuc）尺寸小（19kD），發(fā)射信號強（460nm發(fā)射峰），并且發(fā)射光譜較窄，降低了供體信號“溢漏”到受體發(fā)射通道的可能性。 選擇紅色熒光素酶作為BRET配體 (618nm發(fā)射) 通過共價鍵連接到HaloTag，這允許相當大的光譜分離（超過150nm），從而確保非常高的信噪比。 然而，盡管比典型的BRET檢測方法優(yōu)越，NanoBRET的性能仍然取決于選擇合適的酶標儀。Promega強烈建議使用能夠測量雙濾光片波長的儀器，Thermo Scientific Varioskan LUX多功能酶標儀具備測量雙濾光片波長的能力，非常適合進行NanoBRET?檢測。 選擇次優(yōu)濾光片可能會損害試驗性能并降低數(shù)據(jù)質(zhì)量。根據(jù)Promega的說法，理想情況下供體信號應(yīng)該用中心波長為460nm的帶通濾光片（BP）和一個從600-610nm開始的長通濾光片（LP）來測量，以收集所有受體發(fā)射信號。使用適當?shù)腖P濾光片收集受體信號對于確保檢測試劑的靈敏度尤為重要。 96孔板和384孔板，1X PBS/0.1%BSA，NanoBRET?控制蛋白組，NanoBRET? Nano-Glo?底物。 用1X PBS/0.1%BSA稀釋NanoBRET Nano-Glo底物，稀釋250倍制備成2X溶液。將不同濃度的反應(yīng)液每孔加50μl，并加入等量的2X NanoBRET Nano-Glo底物 (50μl)。最后一種試劑用Varioskan LUX添加。在加入底物后10分鐘內(nèi)，使用Varioskan LUX和選擇的濾光片檢測供體和受體發(fā)射光信號。 儀器啟動前，需要安裝適當?shù)臑V光片。為此，請按照儀器手冊中的說明將濾光片安裝到Varioskan LUX中。需要注意的是，在安裝F600LP或F610LP濾光片時，即使這些濾光片沒有波長范圍，也必須在Thermo Scientific SkanIt?軟件中定義一個波長范圍，可以設(shè)置600-999nm。 添加一個動力學環(huán)，選擇總時間（或讀數(shù)次數(shù)）和動力學間隔。在此測試中，以1分鐘為間隔進行20次讀數(shù)。注意：反應(yīng)開始后的前10分鐘內(nèi)，受體和供體發(fā)射信號的動力學衰減非常顯著（如圖2所示）。然而，供體和受體信號的衰減速度保持不變，因此在較長的測量時間內(nèi)計算出的NanoBRET比值不會受到影響。 圖2 在本次案例中，在讀數(shù)為1時用中高速自動分液50μl NanoBRET Nano-Glo底物。 選擇用于測量NanoBRET的濾光片對，并設(shè)置1000毫秒的測量時間，使用自動增益。 注意：通常情況下，改變增益以增強受體發(fā)射信號并不能改善NanoBRET結(jié)果（改變增益會同時放大信號和背景噪聲）。然而，在受體發(fā)射信號飽和的情況下，可以降低增益以獲得非飽和讀數(shù)。 在0%濃度（沒有nanoBRET信號）和100%濃度（最大nanoBRET信號）的孔中測量受體和發(fā)射光譜。使用波長范圍為400–700nm（以1nm步進），測量時間為100ms。 通過將受體發(fā)射信號值除以供體發(fā)射信號值（Acceptor Em/Donor Em）來計算每個樣本的NanoBRET比值。 通過從樣品中減去對照（無相互作用）的NanoBRET比值來計算校正后的NanoBRET比值。 對校正后的 NanoBRET 比值與濃度的依賴關(guān)系進行線性回歸分析，并計算曲線的斜率。 如果儀器正確地檢測到NanoBRET信號，應(yīng)該獲得一條線性曲線。使用以下公式計算定量限（LOQ）和檢測限（LOD）。注意：無相互作用對照（下圖）對應(yīng)于0%濃度樣本。 使用NanoBRET比值的均值和標準差來計算每個濃度篩選窗口系數(shù)值（Z’）以評估該檢測方法在各個濃度下的性能： 使用Promega控制蛋白組進行的NanoBRET檢測顯示，在96孔板中，使用兩種不同的發(fā)射濾光片收集受體信號時，Varioskan LUX 檢測到的NanoBRET信號保持線性（圖3）。 圖3 當使用波長為600或610nm濾光片收集受體信號時，儀器性能指標LOQ和LOD值也高度相似（表1）。使用Varioskan LUX，兩種情況下的LOQ濃度都在0.2%左右，表明相對于總供體群體，含有0.2%供體受體（BRET）對的樣本從統(tǒng)計上與只含有供體分子的樣本區(qū)分開來。 NanoBRET是一種出色的篩選工具。根據(jù)這里獲得的結(jié)果，還可以得出結(jié)論：在1%最大NanoBRET效率下進行篩選優(yōu)化，無論Varioskan LUX測量時采用哪個NanoBRET受體發(fā)射濾光片（600或610nm），都可以產(chǎn)生極好的質(zhì)量參數(shù)（Z' > 0.8）。 當在384孔板中運行時，該分析方法也表現(xiàn)良好。在這種情況下測量的最低檢出限 (LOD) 只輕微增加到0.35%(圖4)。這使得NanoBRET和Varioskan LUX的結(jié)合對于大型化學抑制劑篩選受體供體對的檢測非常有用。 圖4 在Varioskan LUX中選擇多重化學發(fā)光檢測濾光片，可實現(xiàn)NanoBRET 的性能，這是一種由Promega開發(fā)的技術(shù)，非常適合對活細胞中的蛋白質(zhì)相互作用進行動態(tài)研究。我們建議使用中心波長約為460nm（發(fā)射波長為450nm，帶寬為80nm）的帶通 (BP) 濾光片測量供體發(fā)射信號，使用起始波長為600或610nm的長通 (LP) 濾光片測量受體發(fā)射信號。
