顱骨作為高度精密調(diào)控的組織，其發(fā)育與再生過程受嚴(yán)格分子調(diào)控。顱骨干細(xì)胞的命運(yùn)決定及向成骨細(xì)胞譜系的定向分化，對(duì)顱骨正常發(fā)育與損傷修復(fù)至關(guān)重要。然而，顱骨干細(xì)胞如何精確調(diào)控顱骨發(fā)育與再生的分子機(jī)制，一直是科學(xué)界亟待解決的關(guān)鍵問題。

2025年3月12日，浙江理工大學(xué)陳貴錢課題組在國(guó)際權(quán)威期刊《自然-通訊》（Nature Communications，影響因子14.7）發(fā)表題為“Nf2-FAK signaling axis is critical for cranial bone ossification and regeneration”的重要研究成果。該研究揭示Nf2-FAK信號(hào)軸在顱骨干細(xì)胞命運(yùn)決定及顱骨發(fā)育與再生中的核心調(diào)控作用。

研究團(tuán)隊(duì)通過高通量測(cè)序篩選新靶點(diǎn)，結(jié)合條件性基因敲除小鼠模型，發(fā)現(xiàn)Nf2基因在顱骨組織中特異性高表達(dá)。課題組通過構(gòu)建顱骨缺損小鼠模型，結(jié)合誘導(dǎo)性基因敲除和R26-Tomato細(xì)胞示蹤技術(shù)，發(fā)現(xiàn)Nf2缺失顯著延緩顱骨缺損再生進(jìn)程，并抑制遷移至損傷部位的顱縫干細(xì)胞的增殖潛能。接著做了體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，通過慢病毒過表達(dá)、Co-IP及NanoBiT活細(xì)胞蛋白互作實(shí)驗(yàn)，證實(shí)Nf2作為FAK的上游調(diào)控因子，與其直接互作，并通過PI3K/Akt和Erk1/2信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞功能。

這一研究揭示了Nf2-FAK信號(hào)軸在骨發(fā)育與再生中的核心調(diào)控作用，為顱骨缺損再生的臨床干預(yù)提供了新靶點(diǎn)和新策略，具有重要的臨床轉(zhuǎn)化潛力。

文中，研究者用NanoBRET?Nano-Glo?Detection System 試劑盒定量評(píng)估 Nf2 和 FAK 在活細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)相互作用。NanoBRET?系統(tǒng)是一種生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移，它是基于蛋白接近度的檢測(cè)技術(shù)，通過測(cè)量從生物發(fā)光蛋白供體至熒光蛋白受體的能量轉(zhuǎn)移來檢測(cè)蛋白間的相互作用。如圖1所示，Large BiT（LgBiT；17.6kDa）和 Small BiT（SmBiT；11 個(gè)氨基酸）亞基分別與目的蛋白融合，當(dāng)A蛋白表達(dá)時(shí)，蛋白相互作用會(huì)使這兩種亞基極為靠近從而發(fā)出明亮發(fā)光信號(hào)。

圖1

信號(hào)檢測(cè)采用Varioskan LUX (Thermofisher)，配備有適當(dāng)濾光片的能夠依次測(cè)量雙濾光片發(fā)光檢測(cè)功能，使用以下設(shè)置：

總測(cè)量時(shí)間：1000ms

測(cè)量供體信號(hào)濾光片：發(fā)射波長(zhǎng) 450nm/BP 80nm

測(cè)量受體信號(hào)濾光片：發(fā)射波長(zhǎng) 610nm/LP

結(jié)果表明，在小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1中，Nf2-C末端小亞基結(jié)構(gòu)域與FAK-N末端的大亞基結(jié)構(gòu)域相互作用。且Nf2-FAK的生物發(fā)光率約為陰性對(duì)照組的37.6倍，明顯大于活性蛋白的定義：蛋白質(zhì)相互作用閾值（約10倍）（p=0.0001，n=3）（圖2）。

圖2

Thermo Scientific? Varioskan? LUX 多功能酶標(biāo)儀可實(shí)現(xiàn)多種測(cè)定，包括吸光度測(cè)定、熒光強(qiáng)度測(cè)定、化學(xué)發(fā)光測(cè)定、AlphaScreen 測(cè)定和時(shí)間分辨熒光測(cè)定技術(shù)，專為滿足生物科學(xué)研究人員的各種需求而設(shè)計(jì)。該儀器具備智能化的自動(dòng)增益條件功能，簡(jiǎn)化了測(cè)量時(shí)的設(shè)置，其智能安全控件簡(jiǎn)化了工作流程并且有助于避免實(shí)驗(yàn)誤差。Varioskan LUX 提高了多功能酶標(biāo)儀可靠性和易用性標(biāo)準(zhǔn)，最大限度的滿足了研究人員的需要。