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在日常的微量核酸與蛋白質(zhì)定量中，大家都會(huì)或多或少的遇到測量不準(zhǔn)確的問題。這有時(shí)來源于主觀的判斷，也可能因?yàn)榕c其他方法的對比。樣品的定量結(jié)果與預(yù)期值出現(xiàn)一定偏差有時(shí)是正常的事情，可能是因?yàn)椴煌瑴y量方法本身存在的差異，如使用Nano儀器與Qubit的結(jié)果對比，即NQ比（具體可參考“每天都提核酸，聽說過NQ比嗎？”），或者使用紫外法對比HPLC的結(jié)果。而對于單純的使用微量樣品進(jìn)行基于紫外法的定量，如果出現(xiàn)很大的偏差，則可能是由于設(shè)備、樣品狀態(tài)和上樣操作等多種因素造成的，應(yīng)當(dāng)引起重視。
根據(jù)Implen對來自全球的超微量用戶的長期追蹤與統(tǒng)計(jì)，我們總結(jié)出了可能的四種大概率原因，希望大家在設(shè)備使用的過程中多加注意，輕松的使用超微量設(shè)備獲得可靠的結(jié)果。
光程漂移
超微量設(shè)備由于光程漂移而產(chǎn)生誤差的可能性占比為35%，是第一大可能因素。設(shè)備在使用一段時(shí)間后出現(xiàn)的性能下降，可能是相對普遍的，而對于超微量設(shè)備，較大的變數(shù)就在于光程系統(tǒng)的準(zhǔn)確與漂移。各個(gè)品牌都會(huì)采用精密的光程設(shè)計(jì)，精確到微米級別，但隨著設(shè)備的使用，細(xì)小的部件磨損或漂移也可能導(dǎo)致光程的偏差，進(jìn)一步表現(xiàn)為測量結(jié)果的偏差。且這種偏差將會(huì)被放大，這是由于設(shè)備的光程虛擬稀釋倍數(shù)造成的 – 吸光值測量結(jié)果需要乘以光程倍數(shù)，而同時(shí)誤差也將被放大同樣的倍數(shù)。
不同的設(shè)備可能有不同的光程切換設(shè)計(jì)，一些結(jié)構(gòu)在切換的過程中將會(huì)產(chǎn)生機(jī)械切割，需要通過維護(hù)和光程校準(zhǔn)，修復(fù)偏差，可參考廠家的說明書或維護(hù)指南。Implen所采用的真實(shí)光程技術(shù)：即錨定光程切換技術(shù)，采用電磁彈片的切換方式，在兩個(gè)精確定義的光程間切換，無中間位置，可確保光程的準(zhǔn)確性，而無需進(jìn)行維護(hù)和光程校準(zhǔn)。
混勻問題&濁度
樣品的均質(zhì)性是濃度測量的前提，由于混勻或濁度的問題導(dǎo)致的測量誤差，可能性占比達(dá)30%。以正確的方式混勻樣品，是測量前的必要步驟，可通過渦旋、離心、震蕩、彈撥樣品管等多種方式實(shí)現(xiàn)。一些特殊樣品，槍頭取樣的位置不同也可能導(dǎo)致測量結(jié)果不同，如易產(chǎn)生濃度梯度或易沉降的樣品。一些樣品中具有一定的濁度，雖然可通過背景校正進(jìn)行修正，但仍不能排除由此導(dǎo)致的測量誤差，濃度測值通常會(huì)偏高，需要進(jìn)行具體評估。在嚴(yán)格的場合下，可通過雙波長或多元散射校正的方式進(jìn)行修正。NanoPhotometer?具有濁度警告功能，可提示用戶較差的樣品質(zhì)量和潛在問題。
樣品&上樣問題
有時(shí)樣品本身是存在問題的，和上樣問題一起達(dá)到了20%的誤差可能性占比。如一些溶解在高鹽緩沖液或在待測波長處具有吸收的緩沖液中的樣品。在空白測量的時(shí)候，實(shí)際上引入了空白基線的不確定度，樣品測值時(shí)可能會(huì)不穩(wěn)定，甚至?xí)霈F(xiàn)負(fù)數(shù)。因此，樣品成分要具備方法學(xué)適用性。如果確實(shí)存在一些具有共同吸收的成分，則需要具體評估結(jié)果的可靠性，或降低置信預(yù)期。
一些錯(cuò)誤的操作習(xí)慣，尤其是上樣手法，將影響測量結(jié)果。如習(xí)慣使用槍頭涂抹樣品，這將導(dǎo)致樣品過于平鋪在樣品臺(tái)上，實(shí)際用于檢測的樣品量可能減少，無法形成液柱，或不滿足實(shí)際樣品體積。一些容易有氣泡的樣品，如溶解在甘油中的蛋白質(zhì)樣品，移液時(shí)應(yīng)避免吸入氣泡。黏度較高的樣品可利用反向移液，避免吹出氣泡。
樣品蒸發(fā)
在一些場景下，樣品蒸發(fā)的問題將產(chǎn)生可觀的偏差。如設(shè)備放置在空調(diào)出風(fēng)口，樣品液柱不可避免的產(chǎn)生蒸發(fā)，將得到偏高的檢測結(jié)果（但純度比值通常不會(huì)改變）。一些設(shè)備如需在層流或生物安全柜中使用，將影響更大。因此，設(shè)備的放置位置需要遵循廠家的手冊，避免這些外部因素影響（包括震動(dòng)）。采用樣品壓縮法的Implen產(chǎn)品，采用封閉的檢測環(huán)境，可避免測量過程中蒸發(fā)的影響，更可適用于微量樣品動(dòng)力學(xué)分析等應(yīng)用。對于一些含有有機(jī)溶劑成分的樣品，蒸發(fā)的影響更加可觀，一些因素共同作用，可能導(dǎo)致很大的偏差。
以上四類原因是導(dǎo)致微量分光光度計(jì)產(chǎn)生測量誤差的常見可能因素，有時(shí)候可能是多種因素共同作用導(dǎo)致測量偏差較大，充分了解設(shè)備的原理、操作方法和樣品狀況，有助于獲得更加可靠的數(shù)據(jù)。找出原因，對癥下藥，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)過程，更加輕松、省心的進(jìn)行測量。關(guān)于超微量的任何問題，您都可以咨詢德國IMPLEN。
